DOI: 10.24060/2076-3093-2020-10-2-108-114

Введение. Существует множество протоколов выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты (РНК) и ее фракций, таких как микро-РНК и длинные некодирующие РНК (нкРНК), из различных клеточных линий и тканей, но получение высоких количественных и качественных показателей из определенных тканей, как в случае студенистого ядра, остается сложной задачей. Студенистое ядро входит в число тканей, которые бросают вызов обычным методам выделения тотальной РНК и ее фракций из-за низкого содержания клеток и высокого содержания таких биополимеров, как протеогликаны и гликопротеины, которые нарушают чистоту и выход. Отсутствие большинства воспроизводимых методов для выделения тотальной РНК и ее фракций непосредственно студенистого ядра затрудняет эффективное применение ПЦР-анализа в реальном времени для последующего изучения изменения профиля экспрессии микро-РНК и днРНК при дегенерации межпозвоночного диска. В данном исследовании использована способность коллагеназы II типа расщеплять соединительную ткань для улучшения выделения тотальной РНК и ее фракций из пульпозного ядра и применено сравнение с классическим методом выделения РНК.

Материалы и методы. Образцы студенистого ядра (n = 8) были получены в период с сентября 2017 по декабрь 2018 года от пациентов с диагнозом «межпозвоночная грыжа пояснично-крестцового отдела» во время операции. Половина образцов подвергалась классическому, другая половина — оригинальному способу выделения РНК.

Результаты и обсуждение. Метод ферментативного расщепления для извлечения тотальной РНК и ее фракций из студенистого ядра межпозвоночного диска позволил достичь идеальной целостности и практически высокой чистоты. Не было никакого загрязнения белка, полисахаридов или коллагена.

Заключение. Таким образом, представлен метод, который позволяет повысить количественные и качественные показатели выхода тотальной РНК и ее фракций из студенистого ядра межпозвоночного диска, позволяющий проводить дальнейшие исследования по профилированию экспрессии микро-РНК и днРНК с помощью ПЦР в реальном времени с получением удовлетворительных результатов среднего значения порогового цикла.

DOI: 10.24060/2076-3093-2020-10-2-108-114

Background. With numerous extraction protocols for total RNA and RNA fractions, like microRNA (miRNA) and long non-coding RNA (lncRNA), available for various cell and tissue types, obtaining a high quantitative and qualitative yield from some special material, such as the nucleus pulposus, remains challenging. Nucleus pulposus is troublesome to manage in common RNA isolation protocols due to low cell content and high biopolymer concentrations, including proteoglycans and glycoproteins, which impair overall purity and yield. A major lack of reproducible methods for total and fraction RNA isolation directly from the nucleus pulposus impedes effective real-time PCR applications for downstream miRNA and lncRNA expression profiling in the course of intervertebral disc degeneration. In this study, we exploit the collagenase type II lytic properties to facilitate extraction of total and fraction RNA from the nucleus pulposus and compare results with the standard RNA isolation method.

Materials and methods. Nucleus pulposus samples (n = 8) were obtained from September 2017 to December 2018 from patients with herniated discs in the lumbosacral spine diagnosed during surgery. Equal portions of samples were processed with the standard and original RNA isolation protocols.

Results and discussion. Th e enzymatic lysis method for total and fraction RNA isolation from the nucleus pulposus of intervertebral discs demonstrated excellent integrity and high purity. No protein, polysaccharide or collagen contamination was detected.

Conclusion. Th e method reported allows an improved quantitative and qualitative total and fraction RNA yield from the nucleus pulposus of intervertebral discs. Th e method can be used in future research on miRNA and lncRNA expression profiling with real-time PCR by improving the average cycle threshold value.